VB1诱导肝癌Hep G2细胞生长抑制和凋亡的机制研究

【摘要】第一章VB1对肝癌HepG2细胞生长及其诱导血管生成的影响目的：检定纯化牡荆脂素化合物1(purifiedvitexincompound1,VB1)对人肝癌HepG2细胞生长及其诱导血管生成的抑制作用。方法：体外培养人肝癌细胞系Hep3B、Huh-7和HepG2与永生化人胚肝细胞系L-02以及人脐静脉内皮细胞系HUVE-12。与常规化疗药物氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)对照,MTT比色法检测VB1对不同肝癌细胞系增殖活性的影响。平皿集落形成法和软琼脂培养集落形成法检测不同浓度VB1对HepG2细胞生长的影响。流式细胞术检测VB1对细胞周期进程的影响。内皮管结构形成试验评价VB1对肝癌细胞条件培养基诱导血管生成的影响。结果：1.VB1以浓度依赖方式抑制人肝癌细胞增殖,不同细胞系,其敏感性不同；HepG2细胞系较敏感,Hep3B细胞系中等敏感,对其相对不敏感细胞系为Huh-7细胞；VB1对永生化人胚肝L-02细胞作用微弱。在相同药物浓度下,VB1抑制肝癌细胞增殖活性作用优于常规化疗药物5-FU(p<0.05),并其选择性较高。2.平皿集落形成、软琼脂培养集落形成法结果显示,5.0、10.0μMVB1处理的细胞集落数均显著低于对照组(p<0.05),随着VB1浓度的增加,HepG2细胞集落数逐渐减少,VB1对HepG2细胞生长抑制作用优于相同浓度的5-FU。说明VB1对细胞的锚定依赖性生长和锚定非依赖性生长能力有显著抑制作用,呈浓度依赖性。3.流式细胞术结果显示不同浓度VB1处理理HepG2细胞,处于细胞周期G1期的细胞比率分别为49.2%、53.2%、63.4%,显著高于对照组的42.2%,差异有统计学意义(p<0.05)。随着VB1浓度增加,HepG2细胞周期G1期的细胞由对照组的42.2%升高为63.4%,而S期细胞百分率减少,由对照组的46%下降至24.3%。4.内皮管结构形成试验结果显示不同浓度VBl孵育HepG2细胞的条件培养基抑制人脐静脉内皮细胞系HUVE-12细胞管结构形成能力,与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05),随着VB1浓度的增加,其抑制作用增强。结论：纯化牡荆脂素化合物1(VB1)具有抑制肝细胞癌HepG2细胞增殖、生长和诱导血管生成作用。第二章VB1对肝癌HepG2细胞凋亡的影响目的：检测VB1诱导人肝癌HepG2细胞凋亡作用。方法：碘化丙啶染色流式细胞术定量检测不同浓度VB1作用HepG2细胞的凋亡率；酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞组蛋白/DNA碎片水平；DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞DNA断裂。Caspase活性检测试剂盒测定细胞caspase-3/8/9活性。结果：1.VB1增高HepG2细胞凋亡率,表现为sub-G1期细胞百分率由2.4%增至30.2%,并呈剂量依赖性,其体外诱导细胞凋亡作用优于常规化疗药物5-FU(P<0.05)。2.ELISA检测结果表明,不同浓度VB1或5-FU(10.0μM)作用24h,HepG2细胞内组蛋白/DNA碎片水平显著高于溶媒对照组(P<0.05),且5.0μM和10.0μM的VBl处理的细胞组蛋白/DNA碎片水平显著高于2.5μMVB1处理组(P<0.05)；VB1(10.0μM)诱导细胞组蛋白/DNA碎片水平显著高于相同浓度5-FU(P<0.05)。3.DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示VB1处理诱导DNA核小体间断裂,呈典型的细胞凋亡特征性“梯形”条带图谱,然而,溶媒对照组未见典型的“梯形”条带。4.VB1以剂量依赖方式激活HepG2细胞caspase-3/8/9,通用型caspase抑制齐zVAD-fmk预处理后aspase-3、caspase-8和caspase-9的活化片段明显减少(p<0.05),caspase-3抑制齐zDEVD-fmk、caspase-8抑制剂zIETD-fmk(?)caspase-9抑制齐zLEHD-fmk预处理可减弱VB1激活caspase-3、caspase-8和caspase-9的作用(p<0.05)。结论：纯化牡荆脂素化合物1(VB1)以浓度依赖方式诱导人肝细胞癌HepG2细胞凋亡,并依赖于caspase活化级联反应。第三章VB1诱导肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡作用的机制研究目的：探讨VB1诱导人肝癌HepG2细胞生长及其血管生成抑制和促进细胞凋亡作用分子机制。方法：Westernblot检测不同浓度VB1对HepG2细胞PI3K/AKT及MAPK信号分子蛋白表达以及磷酸化水平影响；同时,检测FOXO3a总蛋白及相应磷酸化蛋白的表达水平；最后,分析FOX03a下游细胞周期调节蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平改变。Westernblot和ELISA检测不同浓度VB1对HepG2细胞VEGF合成和分泌的影响。采用药理学特异性阻断剂(MEK抑制剂PD98059)和小干扰RNA(AKT特异性siRNA和FOXO3a特异性siRNA)抑制相应靶基因表达或活性以研究VB1调控肝癌细胞增殖、凋亡信号传导作用的分子机制。结果：1.Westernblot结果显示,随着VB1浓度的升高,HepG2细胞RAS、p-PI3K、p-AKT、p-ERK蛋白的表达逐渐减弱,p-JNK蛋白表达逐渐增强,但不影响其总蛋白的表达水平。2.随着VB1作用浓度的升高,HepG2细胞Fox03a磷酸化水平依次降低,FOXO3a下游靶基因产物p21、p27、TRAIL、DR4、DR5、Bim蛋白表达水平逐渐上调,CyclinD1、Survivn蛋白表达逐渐下调。3.与溶媒对照组细胞相比,不同浓度VB1可明显抑制HepG2细胞VEGF蛋白表达及细胞培养液中VEGF的分泌(P<0.05)。4.AKT特异性siRNA、MEK抑制剂PD98059增强VB1抑制HepG2细胞FOXO3a磷酸化的作用,FOX03a特异性siRNA对p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2表达无影响。5.AKT特异性siRNA、MEK抑制剂PD98059增强VB1抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的效应,而FOX03a特异性siRNA能有效拮抗VB1抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的效应(P<0.05)。结论：PI3K/AKT和MAPK信号通路阻断导致FOXO3a转录因子活化参与VB1抑制肝细胞癌HepG2细胞生长及其诱导细胞凋亡。图
【作者】王建刚；
【导师】袁洪；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】肝癌；牡荆脂素；AKT；MAPK；FOXO3a；增殖；血管生成；凋亡；

【参考文献】
[1]张秀标.胶合竹植筋连接结构断裂机理及分析[D].中国林业科学研究院,木基复合材料科学与工程,2014,博士.
[2]杨玲.可撤销的指纹模糊金库算法[D].杭州电子科技大学,信号与信息系统,2013,硕士.
[3]邓哲.硅纳米晶体的氧化及发光性能研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[4]何洁.信息不对称下民营中小企业融资方式选择的博弈分析[D].燕山大学,会计学,2013,硕士.
[5]鞠飞,洪玫.神经网络技术在客户信用评价中的应用[J].华南金融电脑,2004,10:95-98.
[6]李玉亭.六朝谢氏与文学[D].江西师范大学,中国古代文学,2004,硕士.
[7]张景祥,王士同,蒋亦樟,倪彤光.基于ISE的核密度估计和随机置换的单一或协同特征的选择方法[J].控制与决策,2015,05:831-838.
[8]张幸玉.《WADA规则》研究[D].重庆大学,国际法,2014,硕士.
[9]王义红,梅生伟,陈家荣.考虑动态电压安全约束的预防控制粒子群优化算法[J].电力系统自动化,2008,12:1-6.
[10]王梦恕,皇甫明.海底隧道修建中的关键问题[J].建筑科学与工程学报,2005,04:1-4.
[11]郑福金.关于“包容性发展”的哲学思考[D].福建师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[12]范丽.一年太极拳的练习对老年人足底压力和平衡能力的影响[D].湖北大学,运动人体科学,2011,硕士.
[13]谯礼.基于改进Sarma法的土质路堑边坡可靠度研究[D].西南交通大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[14]陈晞明.Treg细胞和Foxp3、TGF-β1基因多态性在子痫前期发生中的作用[D].南华大学,免疫学,2013,博士.
[15]冷江.风险社会视角下食品风险管理法律制度研究[D].兰州商学院,经济法学,2013,硕士.
[16]蒋文达.网络服务提供者版权侵权责任研究[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[17]杨小飞.基于GPU计算平台的Lyapunov方程求解[D].哈尔滨工业大学,计算数学,2013,硕士.
[18]梁姝博.合金化增强仿生单元体对低碳钢拉伸性能的影响[D].吉林大学,材料加工工程,2013,硕士.
[19]张海亮.反射式全光纤电流互感器误差研究[D].西安电子科技大学,凝聚态物理,2012,硕士.
[20]朱栋梁.河南省师范类高校排球场馆资源利用现状及影响因素调查报告[D].西北师范大学,运动训练,2013,硕士.
[21]赵龙.基于NWP和改进BP神经网络的风电功率预测研究[D].北京交通大学,2015.
[22]孙东海.N-环己基马来酰亚胺耐热改性PMMA的研究[D].河北大学,高分子化学与物理,2002,硕士.
[23]谭为.踇展肌上缘动脉弓为蒂岛状皮瓣的解剖学基础与数字化[D].南方医科大学,人体解剖学,2012,硕士.
[24]黄婧.我国城镇居民资产组合财富效应比较研究[D].长沙理工大学,统计学,2012,硕士.
[25]刘智超.嵌入式网络攻击检测系统研究与应用[D].成都理工大学,计算机技术,2013,硕士.
[26]李沅栋.人均GDP与中等职业教育关联度研究[D].浙江工业大学,2012.
[27]姜鹏程.边界态对双层石墨烯的电导和谷极化的影响[D].河北师范大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[28]张叶.全国文化信息资源共享工程资源建设模式及其保障机制研究[D].西北大学,图书馆学,2014,硕士.
[29]王慧玲.污泥微泡扩增性能及其薄层干燥特性的研究[D].湖南大学,环境工程,2014,硕士.
[30]丁智.盾构隧道掘进对邻近建筑物影响及变形预测研究[D].浙江大学,岩土工程,2014,博士.
[31]章娟.基于MCP技术的低剂量数字X光机[D].浙江大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[32]石佳乐,庄华夏,刘如泰,黄俊,张俊芝.潮差环境下水泥砂浆的抗氯离子侵蚀性能现场试验研究[J].混凝土,2014,10:119-121.
[33]李春来,禹思敏,罗晓曙.一个新的混沌系统的构建与实现[J].物理学报,2012,11:127-136.
[34]宋程.基于VC的文档管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[35]陈炳伟.Th17细胞相关炎症因子与冠心病及动脉硬化关系的研究[D].北京协和医学院,内科学,2014,博士.
[36]王彬.我国著作权延伸性集体管理制度研究[D].大连海事大学,法律,2014,硕士.
[37]李启林.电容器简易分组对二次系统的影响及解决办法[J].电力系统自动化,2006,02:113-115.
[38]马竹梧.X射线测厚影响因素分析、技术进展及其在冶金工业中的应用(上)[J].冶金自动化,2011,01:1-5.
[39]杨敏.新时期革命历史题材戏曲[D].上海大学,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[40]魏胜.敖南油田油藏地质特征及注水开发特征研究[D].浙江大学,地质学,2012,硕士.
[41]邹伟政.基于ZnO薄膜的电声特性研究[D].华中科技大学,光学工程,2013,硕士.
[42]邵琳琳.骨髓增生异常综合征的分层诊断及去甲基化分段治疗[D].山东大学,内科学（专业学位）,2014,博士.
[43]唐彦芳.管理层收购运行中的风险及调控研究[D].西南农业大学,金融学,2004,硕士.
[44]王东妍.创作性戏剧在初中语文教学中的应用[D].云南艺术学院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[45]马琳,金新民,唐芬,梁京哲.小功率单相并网逆变器并网电流的比例谐振控制[J].北京交通大学学报,2010,02:128-132.
[46]李振.基于RFID通信的叉车车载电脑监视系统的设计[D].南京大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[47]张企欢.长沙楼盘景观之自我形象[D].中南林业科技大学,园林植物与观赏园艺,2014,硕士.
[48]徐瑞.屋顶绿化生态化研究[D].北京林业大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[49]尹媛华.用双性同体理论分析《杀死一只知更鸟》[D].河北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[50]乔璐.基于扎根理论的乡村旅游目的地治理机制研究[D].天津财经大学,旅游管理,2012,硕士.